阳离子脂质体制备常用的这5款脂质

 本期AVT小编给大家详细介绍一下阳离子脂质体制备过程中常用的5款脂质，你知道这几款热门脂质具体有哪些吗？它们又有着怎样的应用呢？快来了解下！

 就今年的盛夏时节，AVT可谓是火力全开，不仅带来了高品质高性价比的注射级蔗糖产品，siRNA脂质体产品Onpattro的关键辅料DLin-MC3-DMA，还有DMG-PEG2000，DOTMA正式在艾伟拓上线！

 阳离子脂质DLin-MC3-DMA

 DLin-MC3-DMA作为新型阳离子脂质—可电离化阳离子脂质的代表，具有“低毒高xiao”的优势，它的化学名为4-(N,N-二甲基氨基)丁酸 (6Z,9Z,28Z,31Z)-庚三十碳-6,9,28,31-四稀-19-基脂，分子式C₄₃H₇₉NO₂，是一种无色至淡黄色的油状液体，pKa=6.44。

▲DLin-MC3-DMA

 DLin-MC3-DMA具有独特的pH依赖性电荷可变特性：酸性条件下呈正电性，而生理pH条件下呈电中性。因此，核酸在酸性条件下被包裹，形成的脂质体在血液中则具有很小的正电荷密度，即很低的细胞毒性。并且DLin-MC3-DMA阳离子脂质体因具有正电性可增加粒子在体内的溶酶体逃逸，提高转染效率，而又不易被巨噬细胞吞噬。利用这些特性，DLin-MC3-DMA制备的阳离子脂质体在siRNA递送方面具有“低毒高xiao”的出色表现。

▲DLin-MC3-DMA结构式

 DLin-MC3-DMA的产品信息是什么？

 中文名称：DLin-MC3-DMA

 商品名：DLin-MC3-DMA

 化学名称：4-(N,N-二甲基氨基)丁酸（二亚油基）甲酯

 分子式：C₄₃H₇₉NO₂

 生产商:艾伟拓（上海）医药科技有限公司

 CAS号：1224606-06-7

 用途：阳离子脂质体

 性状：无色至淡黄色油状液体

 纯度：98%

 溶解性：不溶于水，易溶于DMSO、甲醇、乙醇。

 分子量：642.09

 保存条件：-20℃

 注意事项：避免与强酸、强碱、强氧化性物质接触

▲Onpattro

 2018年全球首ge用于治疗治疗家族性淀粉样多发性神经病变的siRNA脂质体产品Onpattro在美上市，成功打开了沉默细胞基因药物的大门。

 Onpattro中运用的阳离子脂质材料DLin-MC3-DMA也开始备受关注。在这之前，DLin-MC3-DMA在国内市场仍是一片空白。AVT基于深耕磷脂、脂质体、脂肪乳方向多年的资源和经验，推出新产品DLin-MC3-DMA。为阳离子脂质材料提供了一种“低毒高xiao”选择。

 阳离子脂质体，顾名思义，是粒子呈正电性的脂质体制剂，所以提供正电性的阳离子脂质是制剂关键。目前市场上最为常见且使用较多的阳离子类脂有DOTAP、DOTMA、DC-CHOL等，但它们在应用中都有着较大的细胞毒性，因此载药量和安全性两方面常难平衡。

阳离子脂质DMG-PEG2000

 说起DMG-PEG2000这款阳离子脂质材料在RNA药物脂质体中的应用情况，以DMG-PEG2000为代表的新型PEG化脂质的应用优势在哪里呢？AVT推出了自己的新产品DMG-PEG2000，这款随着新冠肺炎mRNA疫苗的火热研制而被大家认识的脂质新材料迅速蹿红，许多小伙伴只知道它和DSPE-mPEG2000一样具有长循环作用且基因转染效果更好，却并不了解背后的具体原理。

 DMG-PEG2000英文全名1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000，中文名可对应翻译为二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000。它的分子式为C₁₂₂H₂₄₂O₅₀，分子量2509.2（平均值），代表结构如下：

 从结构式上就能看出，该材料是通过PEG化修饰了一种短链脂质，C14比常见的DSPE-mPEG2000的C18链短得多，这样最直接的结果就是脂质“锚”嵌插入脂质膜较“浅”，在体循环过程中较易脱落。而这一设计zui大的优势是解决了“PEG-dilemma”。PEG-dilemma主要有三点：

 1、PEG链的空间位阻作用屏蔽脂质体与细胞膜间的相互作用，抑制靶细胞对脂质体的摄取；

 2、屏蔽脂质体与内涵体膜间的相互作用，妨碍“内涵体逃逸”，导致RNA被降解无法顺利进入细胞质；

 3、多次注射PEG化脂质体诱发免疫反应，引起加速血液清除（ABC）现象。

 一般的解决办法有：降低脂质体表面PEG的密度；使用可断裂的PEG-脂质间linker，如酯键、腙键、肽键；使用短链脂质，如采用C14脂质锚定较C18更易于PEG从粒子表面解离。另外，DMG-PEG2000的短链（肉豆蔻酸，C14）比长链（硬脂酸，C18）半衰期小可更快降解，DMG-PEG2000可降低脂质体与细胞间的相互作用及吸附ApoE的能力，获得zui好的细胞基因沉默效果。

 “溶酶体/内涵体逃逸”是RNA类药物递送的关键也是难点，药效高低与其直接相关。使用含有短烷基链的聚乙二醇脂质，可在实现体内逃逸的同时快速解离，以此对抗PEG化造成的“内涵体逃逸”失败现象。这也是为何DSPE-mPEG2000在化药脂质体中常用而核酸类脂质体药物使用DMG-PEG2000的基因沉默/表达水平更高、药效zui好。

 DMG-PEG2000的产品信息是什么？

 中文名称：DMG-PEG2000

 商品名：DMG-PEG2000

 化学名称：1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000

 分子式：C₃₂H₆₂O₅(C₂H₄O)n, n≈45

 生产商：艾伟拓（上海）医药科技有限公司

 CAS号：160743-62-4

 用途：阳离子脂质体

 性状：白色粉末

 溶解性：易溶于甲醇、氯仿，部分溶于水。

 分子量：约2509.2

 保存条件：-20℃

 注意事项：避免与强酸、强碱、强氧化性物质接触

 DMG-PEG2000的图谱信息是这样的：

 ▼ H NMR

 ▼ C NMR

阳离子脂质DOTMA

 近年来基因疗法、抗体疗法、免疫疗法等概念铺天盖地，随之大热的基因递送成为研究焦点。专注辅料开发的小编本以为这是一个新兴领域，没想到简单调研后却发现早在三十多年前科研工作者就已经成功利用阳离子脂质辅DMG-PEG2000的产品信息是什么？料制备脂质体用于基因转染了。接下来要介绍的DOTMA就有着这样的背景。

 DOTMA诞生于1987年，由Felgner等人合成出来并应用于DNA的递送。研究发现，DOTMA制备的单室脂质体可高xiao包载DNA和RNA片段，包封率达百分之百，并且能够很好的被细胞摄取进而表达目标基因，细胞水平上的转染效率较DOTAP高10倍。处方也更简单，不需要添加DOPE等helper lipid。然而DOTMA早先并没有被国内阳离子脂质体研究者所熟知，反而DOTAP、DC-CHOL等应用更多。

 DOTMA中文名二油酰丙基氯化三甲铵，构效关系上两条脂肪酸短链（C14）组成的脂质体较长链（C16或C18）有着更好的转染效果，结构式如下：

 容易与它混淆的DODMA是1，2-二油酰氧基-3-二甲基氨基丙烷，两者铵离子价位不同，带电荷密度不同，自然在用法和效果方面也不一样。

 RNA类药物的效果与选用的阳离子脂质材料密切相关，实验中遇到问题的时候不妨多试几种阳离子脂质材料呀。

 DOTMA的基本信息是什么？

 通用名称：DOTMA

 商品名：DOTMA

 中文名称：二油酰丙基氯化三甲铵

 化学名称：1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷 （氯盐）

 CAS号：104872-42-6

 生产商：艾伟拓（上海）医药科技有限公司

 分子式：C₄₂H₈₄ClNO₂

 用途：阳离子脂质体

 吸湿性：无

 性状：白色固体

 纯度：96%以上

 分子量：670.575

 熔点：35~38℃

 光敏性：有

 保存条件：-20℃

 DOTMA在RNA脂质体中发挥了怎样的作用？

 DOTMA作为一种性能优xiu的阳离子脂质材料被广应用于非病毒基因转染，如Invitrogen的转染试剂Lipofectin。相较于DOTAP、DC-CHOL、DODMA等，它在拥有更高转染效率的同时细胞毒性也更小，因此在药用阳离子脂质体开发中的研究也越来越多。

 DOTMA分子结构上具有“较大尾扇，较小头部”的特性，在脂质体微观形态、体内稳定性以及与细胞膜相作用等方面较DC-CHOL、DOEPC等更好。DOTAP也具有类似的结构性质，但DOTAP对DNA/RNA的包载效率不如DOTMA，在同等药效下DOTAP剂量要比DOTMA高得多，随之而来的细胞毒性也就更大，安全性不如DOTMA。RNA脂质体的效果与其所用阳离子脂质的饱和度（双键数量）、侧链长度、头部基团、N价态等因素密切相关，DOTMA正是综合了这几方面的优势，因此具有很好的应用特性。一般处方设计时与胆固醇、PC类磷脂和PEG化脂质合用。

 DOTMA的其它应用优缺点整理如下：

 优点：

 对核酸包载效率高，RNA/DOTMA脂质复合物中RNA包封率可达百分之百；

 基因转染效率高，某些细胞上能高出DOTAP处方10倍多；

 细胞毒性较小，安全性好；

 可GMP大规模生产。

 缺点：

 价格较高；

 转染效率不如DLin-MC3-DMA等可电离阳离子脂质；

 目前仍处于实验室研究阶段，没有上临床的产品。

 图表引用自：

 R Kolašinac, C Kleusch. Deciphering the Functional Composition of Fusogenic Liposomes. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19(2), 346.

阳离子脂质DOTAP

 根据包载的API不同，可将阳离子脂质体分为两大类，一类是包载以mRNA、siRNA为代表的核酸类药物的脂质体，是基因治疗中研究最多、应用最广的一种非病毒载体；另一类是包载如紫杉醇、喜树碱等小分子抗癌药的脂质体制剂，具有肿瘤新生血管靶向性，对癌症也有双重机制作用下的好疗效。DOTAP是在阳离子脂质体制备中使用最多的药用辅料。

 常见的DOTAP（Cl），化学名为(1,2-二油氧基丙基)三甲基氯化铵，分子式C₄₂H₈₀NO₄Cl，分子量698.6，是一种季铵盐，是带正电荷的两亲性类脂化合物。因为生产工艺的不同，有些性状呈淡黄色蜡状，而工艺好的公司生产的DOTAP则是白色粉末，更便于称量等实际操作。它是两亲分子，结构主要由极性头部(亲水基团)、连接基团、疏水尾部三部分组成。极性头部通常由叔胺或季铵盐构成，后来又研究出咪唑头部、氨基酸头部等。其极性头部情况对核酸分子的包载效率以及细胞毒性均有重要的影响。因含双键和正电荷，DOTAP光敏易氧化易吸湿，氧化后会发黄、变黏，因此实验时操作需快。

 DOTAP最早应用的商业化产品是转染试剂。DOTAP的极性头部通过静电作用与带有负电荷的DNA分子稳定结合，两者混合后可自发形成稳定的复合物。这种转染方法非常温和，可避免脂质转染或者其它方式转染带来的细胞毒性作用，并且转染效率高于其它的脂质试剂。

 DOTAP的产品信息是什么？

 中文名称：DOTAP

 商品名：DOTAP

 化学名称：（2,3-二油酰基-丙基）-三甲基铵-氯盐；(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵

 分子式：C₄₂H₈₀NO₄Cl    

 生产商：艾伟拓（上海）医药科技有限公司

 CAS号：132172-61-3

 级别：药用试剂级别

 用途：阳离子脂质体

 性状：白色固体

 纯度：99%

 分子量：698.56

 熔点：35~38℃

 保存条件：-20±5℃，遮光密闭

 注意事项：避免与强酸、强碱、强氧化性物质接触

 对于核酸药物脂质体而言，处方中DOTAP用量越大载药量及转染效率自然越高，但随之而来细胞毒性也越大，制剂安全性受影响，因此两者需平衡。学术部的同事曾做过小鼠实验研究即毒性：当zeta电位高于+50mV时即有可能出现注射立即死亡现象。对于包载化疗药物而言，载药并不依赖DOTAP，处方中可添加其它中性磷脂如DSPC、DPPC等，使用剂量方面受限较小。

 应用方面，DOTAP价格相对其它种类阳离子脂质而言较低，性价比高，是应用最多的阳离子脂质，已在人体上使用——正在进行III期临床试验EndoTAG-1。

 EndoTAG-1是将紫杉醇包埋于带正电荷的脂质体中所得的阳离子脂质体。处方如下：

 与正常脉管系统不同，肿瘤内皮由于缺乏糖蛋白涂层，进而会形成具有较大负电荷的细胞表面。EndoTag-1可选择性吸附于带负电荷的新生肿瘤血管内皮细胞上，即只破坏肿瘤新生血管，不攻击健康血管。而血管内皮细胞是肿瘤生长必不可少的，因此EndoTAG-1除了API紫杉醇发挥抗癌作用外还因DOTAP提供的正电荷抑制肿瘤新生血管生成，双重机制作用，可有效抑制肿瘤生长。其目前处于全球性的胰腺癌及三阴性乳腺癌III期临床阶段，由台湾杏国药业主导，计划选择10个国jia/地区进行，现已成功开展：美国、台湾地区、法国、匈牙利、南韩、俄罗斯、以色列等七个国jia及地区的III期临床试验。在国内，石药的2类药“注射用紫杉醇阳离子脂质体”项目也使用的是DOTAP，于2019年获CFDA批准进行乳腺癌的I期临床。

 借鉴EndoTag-1我们可建立基于DOTAP阳离子脂质体的技术平台，包裹各类小分子化疗药物。如喜树碱药物阳离子脂质体EndoTag-2，是基于拓扑异构酶I抑制剂原理的新型肿瘤新生血管靶向剂。DOTAP在小分子化疗药物的阳离子脂质体开发上潜力巨大。

阳离子脂质DC-CHOL

 相信对于关注阳离子脂质体的小伙伴来说DC胆固醇较为熟悉，国内外文献里都有其大量的应用性质研究及实验数据的报导。作为制备阳离子脂质体常用的正电荷脂质，小编整理了一些DC-CHOL具有通用性的小知识来和大家做个分享。

 DC-Chol，化学名3β-[N-(N',N'-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇，分子式C₃₂H₅₇N₂O₂Cl，是一种胆固醇衍生物，无光敏性，引湿性，不易氧化，性质较DOTAP更稳定。是制备阳离子脂质体常用的正电荷脂质之一，稳定脂质体膜结构的同时为粒子提供正电性，且细胞毒性较DOTAP小。

 DC-Chol产品信息是什么？

 中文名称：DC胆固醇（供注射用）

 商品名：DC-CHO

 化学名称：3β-[N-(N',N'-二甲基胺乙基)氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐

 分子式：C₃₂H₅₇ClN₂O₂

 生产商：艾伟拓（上海）医药科技有限公司

 CAS号：166023-21-8

 级别：试剂级

 用途：脂质体

 性状：白色粉末

 纯度：98%

 溶解性：可溶于水（部分混溶），易溶于甲醇、乙醇、氯仿、DMSO

 分子量：537.26

 保存条件：-20℃

 注意事项：避免与强酸、强碱、强氧化性物质接触

 在阳离子脂质体的制备中，DC-Chol与合成磷脂DOPE是好搭档，一般常用比例1:1或3:1，此外，处方中也常加入PEG化磷脂配合使用。大量文献报道，DC-Chol/DOPE是低毒高xiao的核酸转染组合，在表达目标基因、提高治疗性疫苗细胞免疫方面十分有效。

 除了应用于治疗疾病的药物外，DC-Chol在阳离子脂质体微泡超声造影剂/超声探针领域也有大量研究和较为普遍的应用。目前应用的微泡通常少量携带电荷或不带电荷,基因携带量难以满足治疗需要。使用DC-Chol制备的新型阳离子超声造影剂可高xiao包载基因并明显提高体内显影能力。

助磷脂DOPE为什么经常出现在脂质体处方中？

 在脂质体制剂的制备过程中，你可能在处方中经常看到二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE的身影，一般来说，正常的阳离子脂质体处方中需含有阳离子脂质、胆固醇、中性助磷脂以及PEG化磷脂，各种脂质成分的选择经常是因项目不同而各异，但在查阅文献过程中大家都会发现一个共同点，那就是处方中常出现DOPE的身影，这是为什么呢？

 DOPE可说是非常常用的助磷脂（helper lipid），在制备阳离子脂质体过程中具有很强的协同作用，主要原理如下：

 1、中性不稳定助类脂：起稳定双层膜和降低阳性成分毒性的作用。

 2、干扰类脂膜，使内涵体膜不稳定：在细胞内能促进DNA、RNA的释放，同时辅助阳离子脂质体的细胞渗透。

 3、能够确定核酸+脂质体复合物的形态，可是脂质体结构从多相Lα相跃迁到六角HII相，使复合物具有良好的可融性，能显zhu提高跨膜效率。

 因此，DOPE的加入可使得阳离子脂质体膜融合更好、稳定性更高、细胞毒性更小。大量研究表明类脂聚合物单独作用时不能转染细胞，而加入DOPE能解决这个问题，比如使用DC-Chol/DOPE可表达CAT基因，而复合物DC-Chol/DOPC则没有活性。

 DOPE这款磷脂的产品信息是什么？

 中文名称：二油酰磷脂酰乙醇胺

 商品名：DOPE

 化学名称：1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺

 英文化学名称：1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine

 分子式：C₄₁H₇₈NO₈P

 生产商：艾伟拓（上海）医药科技有限公司

 CAS号：4004-5-1

 DMF号：28884

 EINECS：200-663-8

 级别：药用试剂级别

 执行标准：企业标准

 用途：脂质体

 溶解性：不溶于水，可溶于氯仿、甲醇、乙醇

 分子量：744.03

 保存条件：-20℃

 注意事项：避免与强酸、强碱、强氧化性物质接触

 本期对阳离子脂质体制备中这5款常用的阳离子脂质的介绍先到这里，从2007年至今，AVT专注脂质体、脂肪乳、微纳米靶向制剂等递药体系，坚持以药用辅料为主要业务方向，"高校+研究所+药企"拓展模式，已覆盖中国所有相关企业。

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