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《mRNA-LNP疫苗的结构与稳定性》文献解读系列七

发布时间:2021-09-07

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改善保质期和储存条件的机会

当需要冷冻以保持疫苗稳定时,终端使用的流通、储存和处理是有严格标准的,成本会相应增加。为了便于流通,疫苗在2–8 °C 下能够保持稳定将是理想的保存条件。在下一节中,我们将专注于研究如何实现这种储存条件,因为这些被视为大规模使用mRNA 疫苗(例如在大流行中)的瓶颈。


4.1 . 辅料

上一节关于mRNA疫苗稳定性的结论是,为了制造更稳定的mRNA-LNP疫苗,稳定mRNA是首要目标。显然,用于mRNA 的疫苗制剂的任何辅料都必须不含RNase。Muralidhara等人的综述中总结了大量有关辅料和制剂环境的影响。


Muralidhara等人提出的一些辅料,Moderna 和 Pfizer/BioNTech 已经将其用于mRNA 疫苗。制剂中的辅料用作缓冲剂、渗透压调节剂和冷冻保护剂或具有双重作用。例如,Moderna 使用 Tris-HCl 缓冲液,它对核酸大分子具有额外的稳定作用,因为Tris-HCl也是一种羟基自由基清除剂。选择这些辅料时,应考虑产品可能需要在低于零的温度下储存,而辅料会受到冷冻的影响。缓冲系统和渗透压调节剂的选择很重要,因为冷冻后 pH 值可能会发生变化,如磷酸钠盐组成的缓冲系统,冷冻时pH会出现 3.5 个pH 单位的下降(在磷酸氢二钠和磷酸二氢钠组成的缓冲体系中,磷酸氢二钠的溶解度会随温度的降低急剧降低,导致缓冲体系中磷酸氢二钠浓度大幅度下降,体系pH也随之发生大幅度降低)。


组氨酸缓冲液在冷冻时pH波动则很小,但是,当从 0°C 下降至 -30°C 时,pH值依然可能会下降 0.5个pH单位。此外,NaCl(渗透压调节剂)溶液的共晶温度为 -21 °C,可以添加一些其他辅料比如抗氧化剂、非还原性自由基清除剂(例如乙醇)或金属螯合剂。然而,我们选用辅料时需要纳入考虑这些辅料在0°C 以下或0°C以上时能多大程度地改善mRNA-LNP 制剂的稳定性。


pH优化对于mRNA 疫苗的稳定性也很重要,因为 pH 会影响 mRNA 的水解速率和LNP稳定性。通常,mRNA 在弱碱性环境中稳定。Moderna 和 Pfizer/BioNTech 疫苗的 pH 值均在 7 到 8 之间。Wayment-Steele 等人指出阳离子脂质完全带正电时表面的pH值可能高于周围的水介质。


4.2 . 冻干

由于水的存在会引发 mRNA-LNP 的降解反应,因此冻干将是提高 mRNA-LNP 制剂长期稳定性的可行途径。辉瑞病毒疫苗研究负责人Philip Dormitzer 已经提到辉瑞希望将冻干技术用于 mRNA-LNP疫苗。此外,Moderna公司的冻干形式的巨细胞病毒mRNA疫苗(mRNA-1647) 已进入2期临床试验,公司宣称该疫苗在5 °C 保存的保质期≥ 18 个月。但是,目前在公开资料中找不到有关该制剂方和生产工艺的详细信息。


冷冻干燥广用于病毒灭活疫苗,关于冷冻干燥技术应用于mRNA制剂也进行了相关研究,证明了冷冻干燥可以提高mRNA的稳定。琼斯等人的研究表明,用海藻糖配制的冻干mRNA在4°C下可稳定储存长达10个月。脂质纳米颗粒也可以被成功冷冻干燥,在冷冻干燥过程中,结构可能会被改变,因此制剂中应包含稳定这些胶体颗粒的冻干保护剂,蔗糖或海藻糖常用于冻干保护。对mRNA 或 LNP 的研究表明,冻干可能是提高mRNA-LNP 稳定性的一种可行方式,能够使mRNA-LNP疫苗在更高的温度下储存。然而,冻干也有其缺点,因为冻干制剂需要在给药前重新配制,并且冻干工艺是一个相对昂贵、耗能和耗时的过程。另一方面,保持 mRNA 疫苗深度冷冻也是有代价的,因此下一步应当研究冻干提高mRNA-LNP 制剂稳定性的可行性。


Shirane等人将含乙醇的siRNA-LNP制剂冻干后再进行复溶,随后用复溶的制剂和新鲜制备的(通过超滤去除乙醇)的制剂分别给药,动物体内的基因敲除效率没有差异。这些研究结果在一定程度上表明了mRNA-LNP 冻干的可行性,同时也应当考虑研究中所用的siRNA和mRNA之间存在差异。


关于mRNA-LNP 冻干研究的公开数据很少,但赵等人近发表了一篇论文,研究 mRNA 脂质纳米粒。他们研究了这些含有可电离阳离子脂质的纳米颗粒的冷冻干燥效果,文章中没有提供冷冻干燥过程的细节。与Shirane 等人获得的 siRNA-LNPs 数据相反,他们发现冻干前和冻干复溶后,体外测试显示活性没有损失,但体内活性却有所下降。因此,mRNA-LNPs 的冷冻干燥可能比研究报道的更为困难,阐明体内活性下降背后的机制将是十分重要的。可能是配方不适合冷冻干燥,或者冻干过程本身存在缺陷,作者推测可能是冻干导致mRNA-LNP纳米结构的改变导致体内活性下降,因为这种改变可能会影响mRNA-LNP微粒与血清蛋白结合的特性,而这些特性在体外研究中是无法显示的。因此,进一步改进制剂方和冷冻干燥工艺可能会达到较优的mRNA-LNP冻干效果。


另一种方法,如果mRNA-LNPs的冻干有问题,可以改成单独冻干mRNA并在给药前与 LNPs 结合。Ball等人用了相反的方法,他们通过用siRNA的乙醇溶液与冷冻干燥后复溶的LNP结合。他们终总结到:“向复溶后的LNP溶液中加入乙醇既不方便也不实用,因为在用于动物或临床之前需要透析除去乙醇”。Leavit等人发现将mRNA冻干复溶后与空白LNP混悬液混合, mRNA 被LNP包封,给药结果显示mRNA依然具有活性。


除了需要在冻干过程中保持 mRNA-LNP 的完整性之外,冻干工艺还有其他局限性,例如该冻干过程高能耗和需要其他成本,在疾病大流行时,在全球范围内急需的冻干产能无法在短时间得到满足。因此需要考虑替代的干燥技术,关于mRNA-LNP 的喷雾干燥研究只能找到一篇文献,该喷雾干燥过程需要聚合物(例如 Eudragit)作为 mRNA-LNP 的稳定剂以确保体内活性。超临界干燥技术也是冷冻干燥的另一种可替代选择;它们已被证明适用于其他生物大分子的干燥,如蛋白类药物。


结论和前景


本综述概述了不同因素如何影响mRNA 疫苗在其储存过程中的稳定性。我们得出的结论是,mRNA暴露于水可能是mRNA 疫苗不稳定的主要因素。这意味着减少与水的接触将是提高 mRNA 疫苗稳定性的一种有效的方法。


对mRNA-LNP结构的研究表明,mRNA与可电离的阳离子脂质和水一起位于LNPs的核,这是mRNA可能屏蔽水的重要证据。当前尚不清楚LNP 中的可电离阳离子脂质是否以及如何与mRNA相互作用,这需要更多的研究工作来确认LNP内部结构。LNP内部的pH值已被确定为与其稳定性密切相关。另一个需要研究的问题是专门分析 mRNA 分子的降解类型,以及序列调整是否有助于维持链的完整性。这也可以与 mRNA 的二级和三级结构的表征和优化相结合,因为有迹象表明一些折叠结构更为稳定。


本报告是对 mRNA-LNP 疫苗不稳定性背后的因素的文献综述,还指出了规避这些不稳定性因素的解决方案,从而开发出能耐受更高储存温度的mRNA-LNP疫苗,从而解决当前疫苗流通过程所需储存条件苛刻的问题。


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